La construction de l'église a débuté en style gothique flamboyant par le choeur vers 1430, s'est poursuivi par le transept, pour s'achever dans les années 1530-1540 par la nef et la façade qui adopta le style de la 1ère Renaissance cher au Val de Loire. Les proportions "ramassées" de ce bel édifice en brique et pierre s'expliquent sans doute par les contraintes topographique de la ville, enfermée autrefois dans ses fortifications et menacée par les crues de la Saône. L'église, ouverte à la visite, conserve un intéressant mobilier, parmi lequel le baldaquin Louis XVI du sculpteur Antoine Marquetty au dessus du maître-autel, la chaire à précher datée 1604 en marbre de Franche-Comté, et l'orgue de 1768 du facteur Bénigne Boillot (1725-1785, né à Nuits-Saint-Georges, établi à Dijon). D'autres éléments, plus anecdotiques, viennent rappeler que Saint-Jean-de-Losne était un important port fluvial : une maquette de bateau de 1826 suspendue au dessus de l'autel Saint-Nicolas, patron des mariniers, et des volets ménagés dans le tambour de l'une des entrées latérales pour se recueillir ou suivre les offices de l'extérieur (Catherine Chedeau, "L'église de Saint-Jean-de-Losne", Congrès archéologique de France, 152e session, Côte-d'Or, 1994, p. 123-135. Paris, Société française d'archéologie, 1998 ; Pierre-Marie Guéritey, "Le mobilier de l'église de Saint-Jean-de-Losne", Mémoires de la Commission des Antiquités de Côte-d'Or, t. XL, 2002-2004, p. 251-257 ; L'Eglise Saint-Jean-Baptiste et son orgue, par le Syndicat d'initiative de la ville de Saint-Jean-de-Losne. Saint-Jean-de-Losne, 1990).